A Convergent Enantioselective Route to Structurally Diverse 6-Deoxytetracycline Antibiotics
「其實板主的背景與專長是有機合成（Organic synthesis）與生物有機（Bioorganic）的領域，但過去整理了太多與化學似乎不是那麼有關的科學文章，感覺好像會被暗批 "不務正業"，因此最近就以有機化學的角度來寫一些跟抗生素有關的文章好了。首先在這一篇文章中，我們將介紹在 2005 年《Science》期刊中發表過的一篇嶄新的「四環黴素」合成方法。」
四環黴素（Tetracycline），是一種中度廣效型的抗生素，它的外包裝如下所示：
圖1. 四環黴素商品包裝及膠囊外觀（Source：http://wwwapp1.fda.moph.go.th/drug/eng/zone_counterfeit/cd_borderline/TETRACYCLINE%20HYDROCHLORIDE.jpg）
對於革蘭氏陽性及陰性細菌感染的疾病均有有效的抑制功效。四環黴素的藥理機轉主要是它透過可逆性地與 30S 核糖體次單元結合，阻斷轉移 RNA（transfer RNA）與訊息 RNA（messenger RNA）－核糖體復合體結合，使新的氨基酸單體無法加到正在成長中的胜肽鏈，阻斷了核糖體合成蛋白質；同時它可以與細菌筴膜上之運輸蛋白結合完成阻斷菌體生理功能，達到抑制細菌生長的效果。主要用於治療細菌感染（如黴漿菌、披衣菌……等等）及幫助控制青春痘；
圖2. 四環黴素抑制胜肽鏈的延長（Source：http://xray.imsb.au.dk/~deb/antibiotics_research.php）
由於四環黴素結構中有許多的羥基（－OH，如圖 3），在人體內會結合許多二價或三價的金屬離子（如鈣離子、鐵離子），因此在服用四環黴素的過程中，避免同時服用含有二價或三價陽離子藥物或食物（如：胃藥、鈣片、鋁制酸劑、鎂鹽、鐵劑、奶製品或 sucralfate 等）以免這些金屬離子會與四環黴素結合而排出體外，進而降低療效。同時由於四環黴素具有光敏感性，因此在服用之後應避免直接日曬，外出時應做好防曬措施。此外，服用四環黴素也有可能會造成牙齒呈現黃色或灰色。
一般而言，在藥物化學領域當中，有關新型抗生素的發展與發現，往往受限於「化學合成（chemical synthesis）」的高難度障礙。怎麼說呢，我想大家應該都聽過「四環黴素（Tetracycline）」或是紅黴素（Erythromycin）這類抗生素名字吧？因為通常這類從天然界中得到的抗生素往往都具有相當複雜的骨架結構，也因此大大的增加了人工合成的難度與挑戰。當然相對的，以化學合成的方式製備這類抗生素所需要投入的金錢與時間就極其驚人。
圖3. 擁有複雜骨架的四環黴素（tetracycline）與紅黴素（erythromycin）結構
以上述這兩個抗生素來說，對於廣泛的細菌感染都提供了相當有效的醫療效用。然而在過去這幾十年來，卻因為抗生素的濫用造成越來越多的細菌對於這些抗生素產生了廣泛的抗藥性。因此，如何能在現在快速的提供一種找到新型態抗生素的出現，就變得刻不容緩。(1-3)
說來也許大家並不相信，其實就以四環黴素（圖 3）來說好了，在過去超過 50 年的化學發展中，由於這類化合物多半都是從天然物當中先分離出來然後再加以化學修飾，也就是利用所謂的半合成路徑（semisynthesis）來合成，因此這麼久的時間來，只有變動了四環黴素環上的極少數位置來做研究。換句話說，要改變四環黴素結構上面的困難度有多大，可想而知。不過現在也有許多的研究捨棄了上述的方法而改採直接由「生合成路徑（biosynthetic pathways）」下手，也就是說當細菌或是微生物在產生這類的化合物時，我們就透過分子生物的方法改變這些微生物體內的基因結構，由於基因改變會造成末期酵素結構的改變，因此得以讓他們在生產的過程當中將我們所需要的基團直接導入。接著再利用酵素排列組合的方式來生產我們需要的特殊片段之結構 (4)。例如下圖 4a 與 4b 就是利用酵素的方式在紅黴素上組裝各種的基團的圖形。透過這樣的方式，使得天然物的來源就不只是萃取或是化學合成，還可運用生物工程或是基因工程來大量生產。
圖4a. 以酵素模組合成 Polyketide 紅黴素（Source：http://biotica.co.uk/hybrid.htm）
圖4b.利用 polyketide synthase 模組合成 polyketide 後，進一步在組裝成為紅黴素。（Source：Nature Reviews Microbiology 2005, 3, 925-936）
回到四環黴素身上，從圖 3 中的結構可看出四環黴素是由四個六角環（至右到左分別標上 A、B、C 與 D）以直線性排列的方式所組合而成。其中如果將 C 環上面 6 號位置的羥基（-OH）拿掉，只剩下一個甲基（-CH3）的這個衍生物，在臨床上也是具有潛力的一個藥物。這是因為當這個羥基被移除之後，大大的增加了四環黴素的抗水解能力，因此在抗菌的活性篩選中具有與四環黴素同等或更好的開發潛力。(5-6) 而臨床上已經在使用的 6-去羥基四環黴素之藥物包含有 doxycycline 與 minocycline 等。可惜的是這些四環黴素衍生物若是要從天然界中取得，就像是緣木求魚般的困難，而且它的合成路徑也並不簡單。
圖5. doxycycline 與 minocycline 結構
有鑑於此，在 2005 年時，在哈佛大學（Harvard University）化學及化學生物學系的 Andrew G. Myers 教授（圖 6）發展了一套更簡便且更有效率的合成四環黴素之方法，並將研究成果發表於 2005 年 308 期的《Science》期刊上。
圖6. Andrew G. Myers 教授（圖片來源：http://www.chem.harvard.edu/groups/myers/andrew_g_myers.htm）
他們以苯甲酸為起始物合成出了 6-去羥基四環黴素而且擁有高光學純度。而且 Myers 教授的方法還可以用來製備 5 號位置也是去羥基的四環黴素。只要透過在最後的偶合步驟（coupling reaction）中，將「AB」的前驅物 4 與 5 以及不同的種類的 D 環融合在一起，就可以製造出各式各樣的 6-去羥基四環黴素。如 (-)-doxycycline、(-)-6-deoxytetracycline（化合物 6）、D-環為雜環衍生物（heterocyclic derivatives）的化合物 7 與化合物 8，10-deoxysancycline（化合物 9）與五環黴素衍生物 10 等等。
圖7. 各種四環黴素的衍生物（Source：Science. 2005, 308, 367-368）
在過去有關合成四環黴素被報導過的合成策略中，A-B-C-D 這四個環都是一步一步慢慢的接起來，通常都是由 D 環或是 C-D 連環為起始，通常以這個模式建構四環黴素的產率都不高。舉例來說，有機合成大師 R. B. Woodward 教授在 1968 年提出的合成策略中顯示，他們為了要合成 (+/-)-6-deoxy-6-demethyltetracycline（sancycline）共花了 25 個合成步驟，其總產率大約只有 0.002％。(7) 而 Shemyakin 合成 (+/-)-12a-deoxy-5a,6-anhydrotetracycline (8) 以及 Muxfeldt 合成 (+/-)-5-oxytetracycline (terramycin 共花了 22 步，總產率 0.06％ (9)；同時他們也從 A 環的前驅物 D-葡萄糖胺（D-glucosamine）為起始，合成了 (-)-tetracycline，花了 34 步，總產率也僅只有 0.002％ (10)。截至目前為止，合成四環黴素系統最有效率的，就屬哥倫比亞大學的 Stork 實驗室於 1996 年發表的論文產率最高，他們合成 (+/-)-12a-deoxytetracycline 僅花了 16 步，總產率達到 25％（如圖 8 所示）。(11)
圖8. Stork 實驗室製備 (+/-)-12a-deoxytetracyclin 流程簡圖
而在這邊，Myers 研究團隊則是利用苯甲酸與酵素 Alcaligenes eutrophus (12-13) 進行反應先行建構 B 環的架構，利用這樣的反應可以得到具有高度光學活性（>95％ enantiomeric excess，簡稱 ee）的雙醇產物 11 產率則有 79％（a 90-g batch, ～13 g/liter）。接著透過羥基誘導效應進行環氧化反應（epoxidation）得到具有 alpha-位相化合物 12。然後再以 trimethylsilyldiazomethane 進行酯化反應、保護，然後在三當量的 tert-butyldimethylsilyltriflate 存在下進行環氧異構化反應而得到產率 70％ 的化合物 13。(13) 接著在低溫先將化合物 benzyloxy-5-dimethylaminomethyl -isoxazole 14 上面的 4 號位置 H 以 n-butylithium 進行去質子化反應得到高活性的鋰鹽，接著將化合物 13 加入，則可以得到酮類化合物 15。接著登場的是整個系列反應當中最關鍵的步驟，那就是 A 環的建構。透過催化量試劑 LiOTf 將化合物 15 於 60 度Ｃ的處理下進行合環反應，然後藉著三氟醋酸（TFA）選擇性的移除位於 allylic 位置的矽醚（silyl ether）保護基而露出自由的羥基，亦即化合物 16（在七個步驟下的產率有 21％）。（圖 9a.）
在這邊研究團隊推測從化合物 15 變成化合物 16 是因為在 N,N-二甲基胺基基團（N,N-dimethylamino group）的存在下，透過 SN-prime allylic 環氧化基團的開環再經由 Sommelet-Hauser 的 [2,3]-sigmatropic 重排反應 (14) 而得到產物。而因為在 A 環上具有一個 alpha-位相的 N,N-二甲基胺基基團，因此當 A-B 在進行環融合時就會誘導生成具有 cis 立體組態的結果。（此 cis 構型結果的產物經過衍生化之後，經由 X-光結晶繞射得到證實）而為了在之後合成各式各樣有關四環黴素的衍生物，因此將這一個化合物 16 分別製備成化合物 4（四個步驟，49％ 產率）與化合物 5（八個步驟，56％ 產率）。
圖9a. 由苯甲酸為起始物製備化合物 16（A-B 環）流程圖
要將化合物 16 轉換成化合物 4，首先必須將 B 環上面的雙鍵轉移。這樣的反應可以透過使用 triphenylphosphine、diethylazodicarboxylate 以及 o-nitrobenzenesulfonylhydrazide 試劑共同反應而得到化合物 17，產率有 74％。(15) 接著再將化合物 17 進行酸性去保護、氧化、再保護，則可以得到化合物 4，產率有 66％（三個步驟後）。
而若要將化合物 16 轉換成化合物 5，則必須先利用硫芐基（-SPh）置換掉 B 環上的羥基得到化合物 18，然後利用具有樟腦骨架的掌性氧化劑將硫原子氧化成碸，接著透過 Mislow-Evans 重排（Mislow-Evans rearrangement）反應在不破壞立體組態下可得到 allylic 醇類化合物 18，四個步驟之下的產率有 66％。(16) 一樣的，在最後進行保護、去保護、氧化反應及再保護反應就可以得到化合物 5，而經過八個反應之後的總產率有 56％。
圖9b. 將 A-B 環化合物 16 為起始物製備化合物 4 與化合物 5 之流程圖
有了化合物 4 與化合物 5 之後，接著就是合成 (-)-Doxycycline 2 的工作了。首先將 D-環前驅物 20 利用強鹼 lithium diisopropylamide（LDA）在存在有 N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine 於無水、極低溫環境下進行 benzylic 位置去質子化反應，接著將化合物 5 加入，接著進行四環偶合反應即可得到化合物 21。透過逆相高效能液相層析儀（RP-HPLC）的分析純化之後確定得到單一構型的產物，且此步驟的產率有 79％。接著在移除保護基（兩步驟加起來總產率有 90％）後以 RP-HPLC 進行純化，則得到 (-)-doxycycline 鹽酸鹽，整個反應流程從第一步驟的苯甲酸開始起算為止，經過十八個步驟後的淨產率為 8.3％。（圖 10）
圖10. 全合成 (-)-doxycycline 流程圖
在順利得到 doxycycline 四環黴素之後，該研究團隊亦利用圖 9b 中所製備出來的化合物 4 與不同的 D 環衍生物進行 Michael-Dieckmann 反應 (17)，而分別得到 (–)-6-Deoxytetracycline 6、Pyridone 衍生物 7、Pyridine 衍生物 8、10-Deoxysancycline 9 以及五環黴素（Pentacycline）衍生物 10 等。並分別拿這些化合物進行細菌的抑制（Minimum inhibitory concentrations，MIC）實驗。
圖11. 不同四環黴素衍生物及其抑菌活性測試結果。（Source：Science. 2005, 308, 395-398）
在找尋最低抑菌濃度實驗中使用了五種革蘭氏陽性菌與五種陰性菌。從圖 11 的研究結果中發現，對於革蘭氏陽性菌一般菌株或是使用對於四環黴素、methicillin 與萬古黴素都具有抗藥性的菌株而言，「五環黴素衍生物」 10（pentacycline derivative）都有相當不錯的抑菌效果。根據這個研究結果顯示出五環黴素也許在藥物臨床上具有一定的抗生素潛力，值得更進一步的去探討與研究。
原始論文：
1. Charest, M. G.; Lerner, C. D.; Brubaker, J. D.; Siegel, D. R.; Myers, A. G. "A Convergent Enantioselective Route to Structurally Diverse 6-Deoxytetracycline Antibiotics" Science 308, 395-398 (2005).
2. http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/308/5720/395
參考文獻：
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